Wie Immunzellen unsere frühesten Atemzüge prägen

In einer kürzlich in der Zeitschrift veröffentlichten Studie Wissenschaftliche Immunologie, Forscher profilieren den Ursprung und die anschließende Differenzierung embryonaler und fetaler Immunzellen während der menschlichen Lungenentwicklung.

Studie: Frühe Entwicklung menschlicher Lungenimmunzellen und ihre Rolle für das Schicksal von Epithelzellen. Bildquelle: u3d / Shutterstock.com

Was wissen wir derzeit über die Entwicklung des fetalen Immunsystems und warum reicht das nicht aus?

Frühere Forschungen haben die Funktionen von Immunzellen bei der Regeneration, der Aufrechterhaltung der Homöostase, insbesondere im Darm und Hoden, sowie der Entwicklung des somatischen Gewebes ausführlich dokumentiert. Ziel der Studien war es, die Struktur, Subtypen und Funktion von Epithel- und Mesenchymzellen aufzuklären; Es besteht jedoch eine Lücke im Verständnis der Forscher über die Prozesse und funktionellen Rollen von Lungenimmunzellen.

Immunzellen gehören zu den wichtigsten Zellen, die für das Überleben eines Säuglings von der Geburt an verantwortlich sind. Angesichts der Abwehrkräfte, die lungenassoziierte Schleimhautimmunzellen gegen in der Luft befindliche Krankheitserreger und inhalierte Toxine bieten, ist der derzeitige Mangel an Literatur zu diesem Thema überraschend. Eine mögliche Erklärung für diese Lücke in der Literatur könnte in der komplexen Natur der Zelldifferenzierung während der Embryonalentwicklung und dem historischen Mangel an Techniken liegen, mit denen diese Differenzierungen während der gesamten Schwangerschaft sicher verfolgt werden können.

Eine entscheidende Frage, die noch unbeantwortet bleibt, ist, ob Immunzellen über die Verteidigung hinausgehende Funktionen haben könnten – könnten sie die Entwicklung des Gewebes, in dem sie sich befinden, modulieren oder auf andere Weise beeinflussen? Die Beantwortung dieser und ähnlicher Fragen im Zusammenhang mit der menschlichen Lungenentwicklung auf zellulärer und molekularer Ebene könnte zur Entstehung neuartiger klinischer Interventionen zur Reparatur und Regeneration der Lunge führen und so Millionen oder sogar Hunderten Millionen Patienten eine Alternative zur Lungentransplantation bieten.

Frühere Forschungen haben die Entwicklungsmorphologie der menschlichen Lunge charakterisiert und den Prozess in fünf zeitlich überlappende Stadien eingeteilt. Diese bestehen aus dem Embryonalstadium zwischen vier und sieben Wochen nach der Empfängnis (pcw), dem pseudoglandulären Stadium zwischen fünf und 17 pcw, dem kanalikulären Stadium zwischen 16 und 26 pcw, dem sacculären Stadium zwischen 24 und 38 pcw und dem alveolären Stadium ab 36 pcw PCW bis 21 Jahre.

Die ersten drei Stadien, insbesondere zwischen fünf und 22 pcw, stellen den am wenigsten verstandenen Zeitraum der Lungenentwicklung dar, obwohl sie zusammen die gesamte Entwicklung epithelialer Stammzellen zu nahezu funktionsfähigen Lungen abdecken.

Über die Studie

Ziel der vorliegenden Studie war es, den zeitlichen Verlauf des fetalen Immunsystems zu bewerten und seine mögliche Rolle bei der Modulation der embryonalen Lungenentwicklung aufzuklären. Menschliche fetale und embryonale Proben wurden aus dem Joint MRC/Wellcome Trust-Stipendium der Human Developmental Biology Resource (HDBR) erworben.

Schwangerschaften, die zwischen dem fünften und dem 22. Lebensjahr abgebrochen wurden, wurden zur Gewinnung von frischem Lungengewebe mit schriftlicher Zustimmung der Spender verwendet. Eine karyotypische Analyse wurde durchgeführt, um sicherzustellen, dass die enthaltenen Proben frei von genetischen Anomalien waren und das „typische“ menschliche Embryonalwachstum darstellten.

Mithilfe der Immunhistochemie (IHC) von Lungengewebe wurden die Art und Menge der Immunzellen in den ersten drei Stadien der embryonalen Lungenentwicklung validiert. Die IHC-Analyse trug außerdem dazu bei, die Standorte der beobachteten Immunzellen und deren Variationen von fünf bis 22 pcw zu bewerten.

Um die Genauigkeit und Zuverlässigkeit der Quantifizierung von Immunzellen zu verbessern, wurde eine dreidimensionale (3D) Quantifizierung mittels konfokaler Mikroskopie gefolgt von Imaris-Softwareanalysen durchgeführt. Berechnete 3D-Bilder wurden zu jedem Zeitpunkt während der Studiendauer mit 2D-Bildern verglichen.

Die Verdauung des Lungengewebes mit anschließender Durchflusszytometrie und fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) wurde verwendet, um IHC-Quantifizierungsschätzungen zu validieren und die relativen Anteile von CD3 aufzuklären⁺CD4⁺CD8⁺und regulatorische T-Zellen (T_regs) als Anteil von CD45⁺ Populationen für das gleiche Entwicklungsstadium und sortieren Sie CD45⁺ Zellen als Vorläufer der Einzelzell-Ribonukleinsäure (RNA)-Sequenzierung (scRNA-sq).

Darüber hinaus diente scRNA-sq dem doppelten Zweck, die Ergebnisse der Durchflusszytometrie zu validieren und die molekulare Charakterisierung von Immunzellen in verschiedenen Proben zu ermöglichen. Zusätzlich wurde die zelluläre Indizierung der Transkriptom- und Epitopsequenzierung (CITE-seq) eingesetzt, um die Auflösung der Ergebnisse zu verbessern.

Humane embryonale Lungenorganoide wurden auch für funktionelle Charakterisierungsexperimente verwendet, einschließlich Zytokinbehandlungen, SMAD-Transkriptionstests (Dual Suppressor of Mothers Against Decapentaplegic) sowie Makrophagen-, dendritische Zellkulturen (DC) und Zytokin-Arrays.

Alle erhaltenen Daten wurden statistischen Analysen unterzogen, die aus einer einseitigen Varianzanalyse (ANOVA) und einer ungepaarten zweiseitigen Analyse bestanden T-TestsResidual Maximum Likelihood Analysis (REML) und Tukeys Post-hoc-Mehrfachvergleichstest.

Studienergebnisse

Die scRNA-seq-, IHC- und funktionellen Organoid-Assays zeigten, dass die Immunzellpopulationen über die fetalen Entwicklungsstadien hinweg erheblich variierten. Vorläufer- und angeborene Immunzellen, einschließlich myeloischer, angeborener lymphoider (ILC) und natürlicher Killerzellen (NK), überwogen in frühen Entwicklungsstadien, wurden jedoch nach und nach durch T- und B-Lymphozyten ersetzt. CD45⁺ Zellen waren in allen Entwicklungsstadien und in allen Lungen-assoziierten Geweberegionen nahezu allgegenwärtig; Ihre relative Menge variierte jedoch je nach Zeit und Ort.

Die molekulare Charakterisierung von Immunzellen ergab 77.559 transkriptomische Profile, von denen 61.757 für die Wissenschaft neu sind. Die Annotation dieser Profile und anschließende Clusteranalysen ergaben 59 Cluster, die für alle bekannten Immunzellkategorien repräsentativ sind. Analysen der Vorläufer dieser Kategorien führten zur Entdeckung unerwartet hoher ILC- und früher lymphoider Vorläuferdichten (ELPs).

Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass Immunzellen während der Entwicklung des Fötus einem zweiphasigen Muster folgen und im achten und 20. Lebensjahr einen Anstieg der Häufigkeit aufweisen. Auswertungen der quantitativen Polymerasekettenreaktion (qPCR) deuten darauf hin, dass der 20-pcw-Peak teilweise auf die Gefäßreifung zurückzuführen sein könnte.

Die B-Zell-Reifung in der Lunge wurde erstmals mithilfe von IHC- und Einzelmolekül-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungstests (smFISH) nachgewiesen. Dies trug zu einer wachsenden Zahl von Beweisen bei, dass das Knochenmark nicht die einzige Quelle reifer B-Zellen ist, was im Widerspruch zu früheren wissenschaftlichen Überzeugungen steht.

Die Expression des Immunglobulin (Ig)-Isotyps in Verbindung mit klonalen Expansionstests ergab, dass Lungenmesenchym und -epithel während der Entwicklung die B-Zell-Homöostase durch die Sekretion modulatorischer Chemokine, einschließlich CCL28, unterstützen.

Die kollektiven Ergebnisse von Transkriptom- und Zytokin-Assays zeigten die komplexen Wechselwirkungen mehrerer von Immunzellen sezernierter Zytokine, von denen wiederum funktionell validiert wurde, dass sie die Differenzierung von Epithelzellen beeinflussen. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Immunzellen während der fetalen Entwicklung einen doppelten Zweck erfüllen: Verteidigung und Lungenentwicklung, und bestätigen damit frühere Hypothesen.

Schlussfolgerungen

In der vorliegenden Studie kombinierten die Forscher modernste transkriptomische Analysen mit IHC, um die strukturellen und funktionellen Rollen von Immunzellen während der fetalen und embryonalen Entwicklung aufzuklären. Auswertungen fetaler Immunzellen im Zeitraum von fünf bis 33 pcw ergaben, dass die vollständige B-Zell-Reifung in der embryonalen Lunge stattfindet, was die vorherrschende Annahme widerlegt, dass das Knochenmark die einzige Quelle reifer B-Zellpopulationen ist.

Es wurde festgestellt, dass Interleukin-1 beta (IL-1β) in großem Umfang von weit verstreuten myeloischen Zellen produziert wird. Es wurde wiederum festgestellt, dass IL-1β die Differenzierung epithelialer Stammzellen moduliert und fördert, was die doppelte Rolle von Immunzellen sowohl bei der Abwehr als auch bei der Entwicklung des Lungenepithels unterstreicht.

Zusammengenommen liefern diese Ergebnisse einen Immunatlas der sich entwickelnden menschlichen Lunge und legen nahe, dass fötale Immunzellen eine Rolle bei der Steuerung der Entwicklung des Lungenepithels spielen.“