In einer aktuellen Studie in NaturmikrobiologieForscher verglichen die Replikation der besorgniserregenden Omicron-Variante (VOC) des schweren akuten respiratorischen Syndroms Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) in menschlichen Zelllinien und primären Atemwegskulturen und maßen die Reaktionen des Wirts auf eine Infektion.
Hintergrund
Die Entwicklung von SARS-CoV-2 hat zur Entwicklung von VOCs geführt, wobei Omicron als erstes Unternehmen weltweit dominante Sub-VOCs entwickelt hat. Diese Sub-VOCs, die entweder ersetzt werden oder gleichzeitig zirkulieren, weisen auf eine Verschiebung von der Wirtsanpassung hin zur immunologischen Flucht vor infektions- und impfstoffinduzierten Gedächtnisreaktionen hin. Die BA.1-Sub-VOC und die BA.2-Sub-VOC von Omicron traten mit SARS-CoV-2-Spike (S)-Proteinmutationen auf, was die Wirksamkeit von Impfstoffen gefährdet. Omicron-Sub-VOCs entwickeln jedoch Mutationen über Spike hinaus, was auf S-unabhängige Anpassungen hindeutet, die möglicherweise entscheidend für die Omicron-Dominanz von SARS-CoV-2 sind.
Über die Studie
In der vorliegenden Studie schlugen die Forscher ein Modell vor, bei dem die frühesten angeborenen Immunantworten des Wirts erheblich zur Übertragung von SARS-CoV-2 beitragen, indem sie beeinflussen, ob Interaktionen mit den ersten Zellen in den Atemwegen eine produktive Infektion bewirken.
Das Team verglich die BA.1- bis BA.5-Replikation mit dem SARS-CoV-2-Delta-VOC in den Calu-3-kultivierten menschlichen Atemwegsepithelzellen (HAEs), um phänotypische Unterschiede zwischen Omicron-Sub-VOCs und die selektiven Kräfte zu bewerten, die ihre Entwicklung vorantreiben. Sie gleichten die Eingangsdosis jeder VOC durch Kopien des SARS-CoV-2-Hüllgens (E) mithilfe einer quantitativen Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) aus. Die Analyse stellte sicher, dass die Zellen äquivalenten Anfangsmengen an SARS-CoV-2-Ribonukleinsäure (RNA), dem primären viralen Pathogen-assoziierten molekularen Mustermolekül (PAMP), ausgesetzt waren und angeborene immunologische Reaktionen des Wirts vom Abwehrtyp stimulierten.
Das Team verglich die angeborenen immunologischen Reaktionen des Wirts auf Omicron-Sub-VOC-Infektionen in Calu-3-Zellen der menschlichen Atemwege und verglich die Replikation in den Zellen bei 32 °C. Sie untersuchten den Mechanismus, der der unterschiedlichen angeborenen Immunaktivierung durch Omicron-Sub-VOCs zugrunde liegt, und ob Omicron-Sub-VOCs unabhängig voneinander eine verstärkte intrinsische Immunsuppression durch ähnliche Mechanismen während der menschlichen Anpassung entwickelt haben. Um die Mechanismen des offenen Leserahmens 6 (ORF6) und seine Rolle bei der Erhöhung des angeborenen Antagonismus durch die VOCs zu untersuchen, nutzte das Team die umgekehrte Genetik und fügte zwei Stoppcodons in die ORF6-Sequenzen des Alpha-VOC (Alpha ΔORF6) und des BA.5-VOC ein ( BA.5 ΔORF6).
Reverse Genetik bestätigte die Eliminierung der ORF6-Expression während der Infektion. Sie bestimmten die Virustiter anhand einer infektiösen Gewebekulturdosis von 50 % (TCID50) in Henrietta Lacks (Hela)-Zellen, die das Angiotensin-Converting-Enzym (ACE2) exprimieren. Das Team verglich die intrazelluläre SARS-CoV-2 E-RNA-Expression mit der von ORF1a und dem nicht-strukturellen Protein 12 (NSP12), das eindeutig in der genomischen RNA (gRNA) kodiert ist, und nutzte dabei die Messung des SARS-CoV-2 E-Gens während der Infektion. Sie führten Durchflusszytometrie durch, um die Interferon (IFN)-β-, λ1-, λ3- und CXC-Motiv-Chemokin-Ligand-10-Spiegel (CXCL10) zu messen, und Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assays (ELISA), um in Zellüberständen abgesonderte Mediatoren nachzuweisen. Sie führten auch Immunfluoreszenz- und Transkriptionsfaktor-Translokationsanalysen durch. Durch die Western-Blot-Analyse wurde die Expression von SARS-CoV-2-Nukleokapsid (N), ORF6, ORF9b, S und β-Actin nachgewiesen.
Ergebnisse
Die Studie untersuchte die Entwicklung von SARS-CoV-2-Varianten, insbesondere der BA.4-Sub-VOC und der BA.5-Sub-VOC, die die angeborene Immunität stärker unterdrücken als frühere Subvarianten. BA.2.75- und XBB-Linien reduzierten auch die Aktivierung des angeborenen Immunsystems, was mit einer erhöhten Expression der viralen angeborenen Antagonisten ORF6 und Nukleokapsid korrelierte. Erhöhte ORF6-Spiegel unterdrückten die angeborenen Reaktionen des Wirts auf eine Infektion, indem sie den IFN-Regulationsfaktor 3 (IRF3) und den Signaltransducer und Aktivator der Transkription 1 (STAT1) verringerten. Omicron, insbesondere die Sub-VOC BA.5, hat einen größeren Zugang zu Zellen, denen die Transmembran-Serin-Protease 2 (TMPRSS2) fehlt, als frühere VOCs wie Delta. Der Eintritt in Calu-3-Zellen war jedoch TMPRSS2-abhängig, was zu zellspezifischen Diskrepanzen bei den VOC-Titern führte.
Eine Calu-3-Infektion menschlicher Atemwegsepithelzellen mit Omicron BA.4 und Omicron BA.5 verringerte die angeborene immunologische Aktivierung deutlich im Vergleich zu den Sub-VOCs BA.1 und BA.2, mit geringerer IFN-beta- und IFN-stimulierter Gen-(ISG)-Induktion , wodurch die immunologischen Reaktionen des Wirts auf Omicron BA.4- und Omicron BA.5-Infektionen reduziert werden. Die langsamere Proliferation von Omicron BA.4 trug wahrscheinlich zu einer geringeren angeborenen immunologischen Aktivierung während Calu-3-Infektionen bei. Die IFN-vermittelte Janus-Kinase (JAK)-STAT-Signalhemmung mit Ruxolitinib rettete Omicron BA.1- und BA.2-Infektionen in menschlichen Calu-3-Atemwegsepithelzellen in größerem Maße als Omicron BA.4 und BA.2, was Unterschiede bei Interferon widerspiegelt Induktion nach Calu-3-Infektionen.
Das Fehlen von Unterschieden bei subgenomischen RNAs (sgRNAs) in S und ORF3a deutete auf keine allgemeine Verbesserung der sgRNA-Synthese hin. Omicron-Sub-VOCs weisen synonyme und nicht-synonyme Mutationen in ORF6 und N auf. Dennoch unterscheiden keine Mutationen die BA.4-Sub-VOC und BA.5-Sub-VOC von BA.1-Sub-VOC und BA.2-Sub-VOC. Dies deutet darauf hin, dass sie unabhängige Mechanismen zur Erhöhung der ORF6- und N-Proteinspiegel oder durch Veränderungen an anderer Stelle im Genom entwickelt haben. Die ORF6-Expression war der Hauptfaktor für den verstärkten angeborenen Immunantagonismus bei neu auftretenden VOCs. Alle Omicron-Subvarianten lösten 24 Stunden nach der Infektion eine deutlich geringere IFNB- und CXCL10-Expression aus als BA.2.
Abschluss
Insgesamt zeigten die Studienergebnisse, dass Omicron-Varianten von SARS-CoV-2 die Umgehung des angeborenen Immunsystems verstärken, indem sie die Expression viraler Proteine erhöhen, was darauf hindeutet, dass die frühesten angeborenen Immunantworten des Wirts für die Übertragung von SARS-CoV-2 entscheidend sind. Viren mit einer verbesserten Fähigkeit, die angeborene Immunität zu umgehen oder zu antagonisieren, wie z. B. eine erhöhte ORF6- und N-Expression, übertragen sich häufiger, da sie die Auslösung oder Abschaltung von Wirtsreaktionen, die diese früheste Replikation unterdrücken, vermeiden können. Das Team geht davon aus, dass die angeborene Immunsuppression bei Ausbruch einer Infektion aufgrund einer höheren Viruslast und Entzündungsreaktionen zu einer Zunahme der Erkrankung führen kann.
