In einer aktuellen Studie veröffentlicht in ACS ZentralwissenschaftForscher verwendeten einen Luciferase-unabhängigen Lumineszenztest, um zu untersuchen, ob das Wildtyp-Spike (S)-Protein des schweren akuten respiratorischen Syndroms Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) eine Pseudo-Luciferase-Aktivität für besitzt Cypridina Luciferin.
Hintergrund
Luciferin (lumineszierendes Substrat) und Luciferase (Enzym) sind für die Biolumineszenz-Detektion (BL) von entscheidender Bedeutung und ermöglichen eine hochselektive Lumineszenz-Detektion von Zielproteinen und -zellen. Luciferin vom Imidazopyrazinon-Typ (IPT) kommt in vielen Meeresarten vor Cypridina Luciferase katalysiert Cypridina Luciferin und Coelenterazin (CTZ). Luciferin emittiert in Gegenwart von Luciferase Licht, kann jedoch mit Nicht-Luciferase-Proteinen oder anderen Biomolekülen reagieren.
Eine aktuelle Studie hat gezeigt, dass das CTZ-Derivat HuLumino menschliches Serumalbumin (HAS) mit einer Genauigkeit, die einem Enzymimmunoassay (ELISA) entspricht, in weniger als einer Minute quantitativ nachweisen kann.
Über die Studie
In der vorliegenden Studie untersuchten Forscher die Anwendung von Cypridina Die oxidative Lumineszenzreaktion von Luciferin, katalysiert durch das SARS-CoV-2 S-Protein, in der Biotechnologie. Sie berichteten, dass das SARS-CoV-2-S-Protein eine Pseudo-Luciferase-Aktivität gegen hat Cypridina Luciferin und untersuchte dessen chemische Struktur und Lumineszenzaktivität.
Das Team untersuchte IPT-Luciferine auf Lichtemission unter Verwendung des Volllängenmonomers des SARS-CoV-2-S-Proteins. Sie kombinierten 36 IPT-Luciferine, darunter zwei native Luciferine (CTZ und Cypridina Luciferin) und 34 bisher bekannte CTZ-Analoga mit S-Protein. Verwendung der drei S-Protein-Untereinheiten [S1, S2, and receptor-binding domain (RBD)]das Team erkannte Potenzial Cypridina Luciferin-Komponenten. Sie verglichen die kinetischen Profile und leiteten die Km- und relativen Kcat-Werte aus Michaelis-Menten-Gleichungsanpassungskurven ab, die unter Verwendung der anfänglichen Lumineszenzintensität für 30 Sekunden erstellt wurden.
Das Team untersuchte den Struktur-Aktivitäts-Zusammenhang von Cypridina Luciferin-Analoga (CLAs) mit SARS-CoV-2-Spike-Glykoproteinen, um Einblicke in die Lumineszenzreaktionen zwischen den zu gewinnen Cypridina Luciferin-Substrat und SARS-CoV-2 S-Glykoproteine. Die funktionellen Gruppen 3-Indolyl und 3-(1-Guanidino)propyl sind einzigartig Cypridina Luciferin und fehlt in anderen natürlich vorkommenden Luciferinen. Um die Auswirkungen der funktionellen chemischen Gruppen auf die enzymatische Lumineszenz von SARS-CoV-2 S zu untersuchen, synthetisierten die Forscher drei CLA-Typen, indem sie die NH-Gruppe von 3-Indolyl an C-6 des ITP-Rings durch ein Heteroatom ersetzten und 3-( 1-Guanidinopropyl-funktionelle Gruppen von C-8 mithilfe synthetischer Verfahren.
Das Team untersuchte die Bindungsaffinität von Cypridina Luciferin zum S-Protein aufgrund der funktionellen 3-(1-Guanidino)propyl-Gruppe an C-8 mithilfe von Computersimulationen mit Autodock Vina. Sie untersuchten auch, ob eine auf Biomolekülen katalysierender Chemilumineszenz (BCL) basierende Testmethode, die die Pseudo-Luciferase-Aktivität des S-Proteins nutzt, das trimere SARS-CoV-2-Spike-Glykoprotein in einer menschlichen Speichelprobe einer Coronavirus-Erkrankung 2019 (COVID-19) nachweisen könnte. Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-negativer Spender ohne Probenvorverarbeitung.
Ergebnisse
Das SARS-CoV-2-Spike-Glykoprotein konnte im menschlichen Speichel mithilfe einer BCL-basierten Testmethode identifiziert werden, die das Protein selektiv und schnell nachweist, ohne dass eine Probenvorverarbeitung erforderlich ist. Die enzymatische Identifizierung der funktionellen 3-(1-Guanidino)propyl-Gruppe in Luciferin an den Schnittstellen der S-Proteineinheiten führte zur Lumineszenzreaktion. Der BCL-Ansatz hat das Potenzial, zentralisierte Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktionstests (RT-PCR) zu ergänzen, die spezielle klinische Einrichtungen, geschultes Personal und lange Diagnosezeiträume erfordern.
Das monomere SARS-CoV-2 S emittierte Licht in Anwesenheit von Cypridina-Luciferin (Signal-Rausch-Verhältnis (S/N) von 35) und nicht bei anderen Luciferinen. Die Ergebnisse zeigten, dass das SARS-CoV-2-S-Protein Pseudo-Luciferase-Aktivität aufweist, und zeigten die Fähigkeit dieser Technologie, zentralisierte Testansätze zu ergänzen. Die geeignete orthogonale Kombination des monomeren SARS-CoV-2 S-Proteins und [signal-to-noise(S/N)ratioof35)ratherthanotherluciferinsThefindingsindicatedthattheSARS-CoV-2Sproteinhadpseudo-luciferaseactivityanddemonstratedtheabilityofthistechnologytosupplementcentralizedtestingapproachesTheappropriateorthogonalcombinationofthemonomericSARS-CoV-2SproteinandCypridina Luciferin zeigte blitzartige kinetische Reaktionen, die in Biolumineszenzsystemen unter Verwendung von IPT-Luciferin beobachtet wurden, mit einem Rückgang der Lumineszenzintensität um etwa 23 % innerhalb einer Minute.
IPT-Luciferin verfügt über funktionelle Gruppen sec-2-Butyl an C-2, 3-Indolyl an C-6 und 3-(1-Guanidino)propyl an C-8-Stellen des ITP-Rings, was die Pseudo-Luciferase-Aktivität von SARS offenbart -CoV-2-Spike-Glykoprotein. Cypridina Luciferin, ein monomeres Spike-Protein, zeigte eine höhere Effizienz bei katalytischen Reaktionen als Fragmentproteine und steigerte die Werte des relativen enzymatischen Umsatzes (kcat) um mehr als 2,6. Einzelne Einheiten tragen möglicherweise nicht zur Lumineszenz von Luciferin bei, sondern eher die Reaktionsstellen, die entstehen, wenn sich Einheiten vereinigen. Das Chemilumineszenzsystem, das Luciferase-abhängige Lumineszenz in aprotischen polaren Flüssigkeiten erzeugt, sollte basierend auf der Lumineszenzintensität als BCL klassifiziert werden.
Der Cypridina Luciferase (Cluc) und Vargula Die Luciferin-Kombination erzeugte eine biolumineszente Quantenausbeute von 30 %, die höchste aller IPT-BL-Systeme auf Luciferinbasis, mit Reaktionsspezifität. Die auf Biomolekülen katalysierende Chemilumineszenz-basierte Technik identifiziert SARS-CoV-2 S quantitativ mithilfe eines „Mix-and-Read“-Ansatzes, bei dem das Luciferin-Protein zum Material hinzugefügt und das Lumineszenzsignal eine Minute lang überwacht wird. Dieser Ansatz erkennt das S-Protein schneller und genauer als die Lateral-Flow-Assay-Methode (LFA), bei der S-Protein-bindende Sialinsäure verwendet wird.
Abschluss
Die Studienergebnisse enthüllten eine neuartige Methode zur Identifizierung von SARS-CoV-2-Antigenen ohne genetische Veränderungen oder Antikörper. Forscher konnten die Pseudo-Luciferase-Aktivität von SARS-CoV-2-Spike-Glykoproteinen im menschlichen Speichel quantifizieren. Das monomere S-Protein leuchtet mit Cypridina Luciferin, aber das trimere S-Protein benötigt mehr Luciferin. Der 3-Indolyl-Substituent an C-6 und die funktionelle 3-(1-Guanidino)propyl-Gruppe sind entscheidend für die Lumineszenzaktivität. Die neuartige Proteinanalysetechnologie kann S-Proteine im menschlichen Speichel in einer Minute ohne Probenvorbereitung nachweisen.
